CRISPR-Cas9 reescreve o DNA do ancilóstomo e o transforma em fábrica de anticorpos

Durante muito tempo, reescrever o DNA de um ancilóstomo pareceu algo inalcançável. A camada externa resistente do verme, o seu ciclo de vida intricado e um genoma ainda pouco caracterizado o mantinham fora do alcance das ferramentas de edição genética que funcionam de modo confiável em bactérias, camundongos e linhagens celulares humanas.

Agora, um grupo liderado por Makedonka Mitreva, professora Gordon R. Miller na Divisão de Doenças Infecciosas do Departamento de Medicina John T. Milliken, na Washington University School of Medicine (WashU Medicine), conseguiu contornar essas barreiras.

Ao introduzir novas instruções genéticas no genoma do ancilóstomo, os pesquisadores converteram o parasita em uma “fábrica” capaz de produzir um anticorpo terapêutico e liberá-lo na corrente sanguínea do hospedeiro.

Repensando os parasitas

Ancilóstomos infectam centenas de milhões de pessoas em regiões tropicais e, em geral, provocam sintomas digestivos leves em adultos saudáveis. Diferentemente da maioria dos parasitas, eles não conseguem se reproduzir dentro do corpo humano.

Com isso, uma infecção controlada permanece controlada - e, caso algum dia seja necessário tratar, uma única dose oral de um antiparasitário elimina os vermes em cerca de 24 horas.

Por décadas, o estudo dos ancilóstomos se concentrou quase exclusivamente no seu papel como causadores de doença. Depois, pesquisadores observaram que pessoas infectadas apresentavam menos inflamação em certas doenças intestinais.

As secreções do verme pareciam diminuir a atividade imune que alimenta quadros como a colite ulcerativa. Essa constatação mudou o rumo do debate: em vez de apenas combater a infecção, cientistas passaram a investigar se os ancilóstomos poderiam ter utilidade terapêutica.

Este trabalho leva essa ideia adiante. Em vez de depender do que o ancilóstomo produz naturalmente, a equipe o programou para fabricar e secretar uma proteína escolhida pelos pesquisadores.

Escolhendo o alvo

Os pesquisadores decidiram trabalhar com a espécie Ancylostoma ceylanicum, um ancilóstomo capaz de infectar humanos.

Como prova de conceito, eles projetaram o verme para produzir um anticorpo compacto que neutraliza a tetrodotoxina - uma neurotoxina paralisante encontrada em baiacus e para a qual não existe antídoto disponível.

O financiamento veio da Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA), com foco em contramedidas biológicas para soldados que atuam em locais remotos.

Reescrevendo o DNA do ancilóstomo

Construir um ancilóstomo geneticamente modificado exigiu resolver desafios que ainda não haviam sido enfrentados. As ferramentas de edição gênica usadas em outros organismos não tinham sido adaptadas à biologia desse verme.

A equipe passou meses localizando um “porto seguro” no genoma do ancilóstomo - uma região em que a inserção de DNA novo não atrapalharia genes próximos nem colocaria em risco a sobrevivência do animal.

Para realizar o procedimento, eles recorreram ao CRISPR-Cas9, uma ferramenta de edição genética de alta precisão, para cortar o DNA do ancilóstomo e inserir o gene do anticorpo anti-tetrodotoxina.

Também foi incluído um sinal de direcionamento para garantir que a proteína resultante fosse exportada para fora do corpo do verme, em vez de permanecer nos seus próprios tecidos. A entrega do material genético nos ovos do ancilóstomo foi feita por eletroporação - um pulso elétrico que abre poros temporários nas membranas celulares.

Vermes completam o ciclo

Os ovos modificados se desenvolveram em larvas e foram introduzidos em hamsters para verificar se os vermes completariam o ciclo de vida e produziriam a proteína. Eles completaram.

O gene inserido também foi transmitido para a geração seguinte, indicando herança estável.

De forma crucial, a inserção não desligou genes vizinhos, e a biologia dos vermes permaneceu intacta.

Anticorpos chegam ao sangue

Quando os hamsters infectados com os vermes engenheirados tiveram sangue coletado 22 dias após a infecção, foi possível detectar no sangue o anticorpo humano produzido pelos parasitas que viviam no intestino.

Em testes laboratoriais com esse sangue, os pesquisadores observaram neutralização de aproximadamente 16% da tetrodotoxina.

Esse valor pode parecer modesto, mas Mitreva ressaltou que se trata de uma prova de conceito inicial.

A equipe segue trabalhando para elevar a produção e a secreção da proteína, e é provável que os resultados atuais subestimem o potencial da plataforma.

Como os vermes se alojam no trato gastrointestinal e liberam a maior parte de seus produtos ali, as concentrações de proteína terapêutica no intestino podem ser bem mais altas do que as que chegaram à corrente sanguínea neste estudo.

Isso torna a plataforma particularmente adequada para condições direcionadas ao intestino, como doença inflamatória intestinal e alergias alimentares.

Potenciais usos médicos

As implicações vão além da tetrodotoxina. Em quantidades controladas, ancilóstomos conseguem passar anos vivendo discretamente dentro de um hospedeiro sem provocar doença grave. Eles oferecem secreções constantes e contínuas, com entrega direta tanto para o revestimento intestinal quanto, potencialmente, para o sangue.

Para doenças crônicas que hoje exigem injeções ou infusões repetidas, essa combinação apresenta algo que nenhuma plataforma medicamentosa convencional entrega.

A doença de Crohn e a colite ulcerativa surgem como candidatas naturais. Também entram na lista condições em que doses pequenas e sustentadas de uma proteína terapêutica poderiam prevenir ou controlar sintomas.

Em locais remotos ou com poucos recursos, uma pessoa poderia receber uma única dose oral de larvas modificadas e manter uma “farmácia viva” atuando dentro do corpo por anos.

Segurança e próximos passos

Antes de qualquer avanço em direção ao uso em humanos, segurança e contenção continuam sendo questões centrais.

Os pesquisadores consideram modificar os vermes para que não produzam ovos, evitando que se espalhem ou se reproduzam no ambiente. Medicamentos injetáveis não oferecem esse tipo de “desligamento” embutido.

“"O que demonstramos é que o conceito funciona de ponta a ponta", disse Mitreva. "Você consegue inserir um gene, o verme produz a proteína, a proteína sai do verme e ela é funcionalmente ativa no hospedeiro."”

A partir daqui, os pesquisadores podem otimizar a plataforma para diferentes doenças e para diferentes concentrações de proteína, conforme a aplicação.

Um sistema biológico que evoluiu para colonizar humanos está sendo redirecionado para beneficiar humanos - e isso exigiu a primeira reescrita bem-sucedida do genoma de um ancilóstomo.